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今天给大家分享的这篇文章是来自明尼苏达大学MariaPieters教授团队关于猪肺炎支原体感染宿主的代谢组学相关研究工作。
猪肺炎支原体是养猪业的一大健康隐患，可引起生长猪患有一种慢性呼吸道疾病-即地方性肺炎(EP)。地方性肺炎通常是慢性的，在几个月的过程中缓慢传播和发展，同时咳嗽、体重增加不佳以及饲料转化率降低是受感染猪的典型症状。在自然条件感染下，猪肺炎支原体的潜伏期很难被预测，因为它取决于病菌感染的剂量、猪的免疫状态以及是否存在相关的继发性呼吸道感染。慢性是猪肺炎支原体感染猪群的突出特征，这可能是由于病原菌具有逃脱适应性免疫监视的能力，同时具有较在猪的生产中，猪肺炎支原体在初次感染猪后的多天内依旧具有传播其病原菌的能力。然而由于与EP相关的死亡率低，通常只有在宰杀的猪中或由于叠加了其他疾病所发生的继发感染而导致死亡后人们才会观察到病猪的死后肺损伤。
由于其苛刻的生长要求，因此对临床样品中猪肺炎支原体的分离培养提出了挑战。目前，针对猪肺炎支原体抗体的血清学检测是现阶段最常用于检测该疾病的方法。然而，尽管这些检测方法在成本和便捷方面具有优势，但也存在着一些局限性，比如检测早期或亚临床感染的灵敏度较低，可能与其他呼吸道共生支原体发生抗原交叉反应，以及缺乏对感染猪和接种疫苗的猪之间的区分。与血清诊断相比，聚合酶链式反应(PCR)检测临床样本中猪肺炎支原体基因组DNA的准确度更高。然而，不同样本类型的PCR检测结果的一致性却各不相同，同时一些样品部位的采集对于活体动物而言并不适用。所有这些情况使得诊断猪肺炎支原体感染极具挑战性。
因此在面对现有的猪肺炎支原体诊断方法的诸多局限性下，我们急需一种新的监测工具来改进或补充现有的猪肺炎支原体诊断。代谢组学作为一种组学工具，近年来已经被广泛的用来研究寄主和病原体之间错综复杂的相互作用。在宿主与病原体相互作用过程中所发生的代谢事件反映了宿主如何对病原体作出反应，以及病原体如何适应并在宿主环境中进行繁殖。代谢组学在人类和动物感染性疾病研究中的应用揭开了有关病*、细菌和寄生虫感染的生化和生理过程的新知识，同时也可以被用于寻找诊断生物标志物。因此为了确定与早期猪肺炎支原体感染相关的代谢变化，作者通过代谢组学分析比较了感染和未感染病原菌猪之间的代谢差异，进而寻找与猪肺炎支原体早期感染相关的潜在代谢标志物。
在这项研究中使用2头猪作为模拟接种对照组，10头猪气管内接种猪肺炎支原体。随后分别于接种后0、2、5、9、14、21和28天采集血清、喉拭子(LS)和气管支气管灌洗液(TBLF)。于28天采集支气管拭子(BS)。用聚合酶链式反应(PCR)在LS、TBLF和BS中证实猪肺炎支原体感染。用高分辨率液相色谱-质谱法(LC-MS)分析血清代谢物。对LC-MS数据进行多变量分析后，通过结构分析确定代谢物标志物。
对LS、TBLF和BS的实时PCR分析证实，在整个研究过程中，模拟接种对照猪的猪肺炎支原体均为阴性。在接种的猪中，从9天开始，所有猪(%)的LS和TBLF中都检测到猪肺炎支原体DNA(图1A)。猪肺炎支原体DNA在TBLF中的载量在14它和21天达到峰值，然后在28天下降(图1B)。此外，在安乐死(28天)的所有接种猪的BS样本中，猪肺炎支原体DNA均呈阳性。在28天时对肺部病变进行死后评分。10头接种猪的病变评分从4%到52%不等，平均得分为18.3%。模拟接种的对照猪未见肉眼可见的肺损伤。
84份来自模拟接种对照和支原体感染猪的血清样本在PCA模型的积分图上的分布表明，在第一主成分中，0、2、5和9天收集的样本与在14、21和28天收集的样本明显分开(图2A)。这一分布表明，无论是模拟接种对照猪还是接种猪，都存在随时间变化而引起代谢变化。更重要的是，感染猪在14和21天的大多数血清样本在模型的第一主成分中与其他样本进一步分离，表明发生了感染反应的代谢变化(图2A)。在PCA模型的负荷图(图2B)中确定了有助于时间和感染依赖性样本分离的代谢物，它们的身份(I-XX)分别被阐明为游离脂肪酸、磷脂和氨基酸代谢物(表1)。
通过系统聚类分析进一步表征了代谢物与样品之间的相关性。与其在PCA模型中的分布情况一致，0、2、5和9天处的样本以及14、21和28天处的样本根据时间形成了两个主要群集(图2C)。促成这种时间依赖性聚集的代谢物主要由各种磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰胆碱(Lyso-PC；图2C)组成。更重要的是，多种游离脂肪酸和一种氨基酸代谢物被确定为感染反应代谢物，因为在14和21天，这些代谢物在接种猪血清中的丰度比模拟接种对照血清高得多(图2C)。
血清中总游离脂肪酸(FFA)和个别游离脂肪酸(肉豆蔻酸、棕榈油酸、油酸和亚油酸)的浓度在接种后14和21天显著升高(p0.05，图3A-E)。对游离氨基酸进行定量分析，以确定血清氨基酸库的状态。α-氨基丁酸（AABA）是一种非蛋白性氨基酸，在接种后14和21天显著增加(p0.05；图4)。
在接种猪的血清中AABA浓度与TBLF猪肺炎支原体Ct值呈显著相关性(p0.05)。基于较低的Ct值显示出负相关(高细菌负荷与AABA浓度增加之间具有较大相关性；图5A)。长链脂肪酸浓度和Ct值也观察到了类似的影响(p0.05；图5B-E)。这表明AABA与长链脂肪酸具有作为猪肺炎支原体诊断代谢标记物的潜力。
综上所述，作者在猪肺炎支原体感染的早期阶段，通过代谢组学技术观察到了宿主氨基酸和脂肪酸图谱发生了显著的变化。同时发现血清中长链脂肪酸含量的增加证明了病原体通过影响宿主进而获得满足自身脂肪酸的需求。同时α-氨基丁酸（AABA）水平的升高和氨基酸动力学的改变也表明宿主体内蛋白质的过度分解代谢，而这些代谢物可能具有作为潜在候选诊断标记物的能力。因此，该研究通过描述猪肺炎支原体感染猪的代谢特征，检测了对早期疾病进程的代谢反应，有助于诊断猪肺炎支原体工具的研发。然而，该实验也存在着一些不足，实验室感染模型与自然感染之间存在着一定的差异性。因此在之后的研究中，对于在实验接种中所观察到的变化需要在自然感染过程中进一步验证。此外，宿主对猪肺炎支原体感染的反应所涉及的分子机制还需要进一步的研究解释。
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