作者：王秀利褚英顾茂胜王传霞杨丹艳王仙武娇
作者单位：徐州市妇幼保健所新生儿疾病筛查中心
引用格式：王秀利,褚英,顾茂胜,等.年至年徐州市新生儿高苯丙氨酸血症筛查及治疗效果[J].中华围产医学杂志,,19(8):-.DOI:10./cma.j.issn.-..08.
摘要
目的了解徐州地区新生儿高苯丙氨酸血症（hyperphenylalaninemia，HPA）的患病率、临床分型、治疗及预后情况。
方法选择年7月1日至年7月1日在徐州地区出生的例活产新生儿，于出生后72h已充分哺乳后采集足跟血，由徐州市妇幼保健所新生儿疾病筛查中心采用荧光定量法测定血苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）浓度。对确诊的例HPA患儿进行尿蝶呤谱分析和红细胞二氢蝶啶还原酶活性测定以鉴别诊断。治疗随访期间定期监测血Phe浓度及智能发育水平，并进行苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase，PAH）基因突变分析。采用Bivariate相关分析法研究血Phe控制浓度与智能发育的关系。
结果（1）徐州地区新生儿HPA的患病率为1/。确诊的例HPA患儿中例（98.11%）诊断为PAH缺乏症，其中90例（33.96%）经典型苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU），84例（31.70%）轻度PKU，86例（32.45%）轻度HPA。5例（1.89%）患儿诊断为四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）缺乏症，均为6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase，PTPS）缺乏症。（2）例HPA患儿中26例拒绝治疗，其中5例为PTPS缺乏症，21例为PKU。拒绝治疗的5例PTPS缺乏症患儿中2例已死亡，另外3例目前智能和体格发育正常。拒绝治疗的21例PKU患儿均存在不同程度的智能发育落后。例接受治疗的PKU患儿中3例已死亡，12例在治疗过程中失访。（3）例接受饮食治疗并随访的PKU患儿末次随访年龄为2个月~12岁，其中例智能发育正常，22例智能发育落后，并且智能发育水平和血Phe控制浓度呈负相关。（4）35例患儿接受PAH基因突变分析，共发现22种基因突变。
结论徐州地区新生儿HPA的患病率显著高于全国平均水平。早期确诊并规范治疗的PKU患儿多智能发育正常，严格控制血Phe浓度对智能发育至关重要。
高苯丙氨酸血症（hyperphenylalaninemia，HPA）是由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase，PAH）缺乏或其辅酶四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）缺乏，导致血苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）浓度增高的一组最常见的常染色体隐性遗传的氨基酸代谢病。高浓度的血Phe及其代谢产物和低浓度的神经递质多巴胺、5-羟色胺均可引起神经系统损害，最终导致患儿智力发育落后，皮肤、毛发色素浅淡和尿液、汗液有鼠尿臭味。HPA新生儿期多无临床症状，早期筛查，及时诊断、治疗，可以保障患儿体格和智能的发育水平。我国于年开始进行HPA的筛查与治疗研究，江苏省新生儿疾病筛查徐州分中心自年7月全面开展此项工作。本研究旨在了解徐州地区HPA的患病率、临床分型及治疗效果，对筛查中发现的例HPA患儿的治疗及预后等情况进行了分析研究。
一、资料与方法
一、研究对象年7月1日至年7月1日江苏省新生儿疾病筛查徐州分中心对徐州市5个区5个医院出生的例活产新生儿进行HPA筛查。12年内共计确诊HPA患儿例，其中男例，女例，男女比例为1.15∶1。
二、研究方法在新生儿出生72h后，充分哺乳8次以上，并在家长知情同意情况下，由经过培训合格的专职医务人员采集新生儿足跟内外侧缘末梢血3滴，滴于专用干滤纸片上，形成直径8mm的血斑，血片两面均匀渗透，自然晾干后制成干滤纸血片，及时送至筛查中心进行检测。
三、HPA筛查新生儿疾病筛查中心应用芬兰Wallac公司生产的0型多功能免疫分析仪，采用化学荧光定量法测定血片中Phe浓度。筛查中心实验人员均经培训合格后上岗。实验室每年参加卫生部临床检验中心的室间质量评价，结果均达到质评要求。每一批实验均带有试剂盒的标准品和质控品，以进行质量控制。
四、诊断与鉴别诊断经化学荧光定量法检测，血Phe浓度μmol/L的新生儿为初筛可疑阳性，对初筛可疑阳性的血片进行复查，若第二次血Phe浓度仍μmol/L，需要进一步进行确诊检查。第二次采血检测仍为阳性的患儿应用串联质谱法检测，由南京市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心完成。串联质谱法测定患儿血Phe、酪氨酸（tyrosine，Tyr）浓度，计算血Phe与Tyr比值，排除其他原因所致的继发性血Phe浓度升高。根据最新诊疗共识[1,2,3]，凡血Phe浓度μmol/L及Phe/Tyr比值2.0的新生儿即可确诊为HPA。
根据不同病因，HPA可分为PAH缺乏症和BH4缺乏症两大类，均为常染色体隐性遗传病[2,4,5]。所有诊断为HPA的患儿必须尽快进行鉴别诊断。鉴别诊断的方法包括尿蝶呤谱分析和红细胞二氢蝶啶还原酶（dihydropteridinereductase，DHPR）活性测定，由上海市儿科医学研究所完成[6]。BH4的合成代谢过程需要5种酶参与，包括6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase，PTPS）、鸟苷三磷酸环化水解酶（guanosinetriphosphatecyclohydrolase，GTPCH）、墨蝶呤还原酶（sepiaptereductase，SR）、蝶呤-4α-甲醇氨脱水酶（pterin-4α-carbinolaminedehydratase，PCD）和DHPR。不同酶缺乏患儿呈现不同的尿蝶呤谱[2,7]。目前采用的尿蝶呤谱分析方法主要用于鉴别PTPS及GTPCH缺乏症，尚不能测定7-生物蝶呤进行PCD缺乏症的鉴别。PTPS缺乏症患儿的尿蝶呤谱分析结果显示尿新蝶呤明显增加，生物蝶呤明显降低，尿新蝶呤与生物蝶呤比值增高，生物蝶呤5%或测不出[8,9]。GTPCH缺乏症患儿的尿蝶呤谱分析结果显示：尿新蝶呤、生物蝶呤都明显降低。PCD缺乏症患儿尿中尿新蝶呤增高，并出现7-生物蝶呤。尿蝶呤谱分析不能完全鉴别DHPR缺乏症，红细胞DHPR活性检测是DHPR缺乏症的确诊方法[10]。DHPR缺乏症患儿DHPR活性极低，多低于正常者活性的5%~10%[7,11,12]。HPA患儿在排除BH4缺乏症后，即可诊断为PAH缺乏症。按照最新诊疗共识[4,5]，PAH缺乏症分为3类：经典型苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）指血Phe浓度≥0μmol/L；轻度PKU指血Phe浓度为~0μmol/L；轻度HPA指血Phe浓度为~μmol/L。
五、基因突变分析在家长知情同意下，留取患儿外周血，提取基因组DNA，采用聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）技术对PAH基因的13个外显子及邻近的内含子区域进行测序，具体由南京市妇幼保健院产前诊断中心或上海市儿科医学研究所完成。
六、治疗与随访正常摄入蛋白质情况下，血Phe浓度μmol/L的PKU患儿均应在完成鉴别诊断后立即治疗，低Phe饮食治疗仍是目前PAH缺乏症的主要治疗方法，同时供给足够的热量、蛋白质，以满足患儿正常生长发育的需要。婴儿期服用低Phe特殊奶粉，6月龄开始添加低Phe主食，1岁后添加低Phe蛋白粉。PKU患儿低Phe特殊奶粉治疗开始后每3天测定血Phe浓度，根据血Phe浓度及时调整饮食；代谢控制稳定后，测定时间可适当调整：1岁以下每周测1次，1~12岁每2周~1个月测1次，12岁以上每1~3个月测1次。各年龄段血Phe浓度控制的理想范围：1岁以下~μmol/L，1~12岁~μmol/L，12岁以上~μmol/L为宜[1,3,4]。
BH4缺乏症患儿按不同病因给予BH4或无Phe特殊饮食及神经递质前体治疗。在正常饮食情况下，PTPS、GTPCH及PCD缺乏症患儿需要补充BH4，1~5mg/（kg·d），分2次口服，使血Phe浓度控制到正常水平[11,12,13]。DHPR缺乏症及BH4治疗困难的患儿采用低Phe特殊奶粉或饮食治疗（同PKU治疗），使血Phe浓度控制到接近正常水平（~μmol/L）[11,12,13]。同时，大多数PTPS、DHPR及GTPCH缺乏症都需要神经递质前体左旋多巴及5-羟色氨酸联合治疗，治疗剂量参考最新诊疗共识[4,5]。DHPR缺乏症患儿易合并继发性脑叶酸缺乏症，需补充四氢叶酸5~20mg/d[11,12,14]。
治疗过程中注意补充维生素、微量元素，定期监测血Phe浓度，并进行生长发育评估和智能发育检测。≤4岁患儿采用Gesell婴幼儿发育量表（包括适应性、精细动作、大动作、语言和个人-社交5个能区评估）测定发育商，其中每个能区75分为智能发育正常，≤75分为智能发育异常。4~≤6岁患儿采用韦氏学前和小学儿童智能量表测定智商。6岁患儿采用韦氏学龄儿童智能量表（修订版）测定智商。智商≥70分为智能发育正常，智商70分为智能发育异常。
结果
一、患病率及临床分型
年7月至年7月徐州地区各年新生儿HPA的筛查情况见表1。
表1年至年徐州地区高苯丙氨酸血症筛查情况
例新生儿足跟血干滤纸血片初筛阳性例，召回采血复查例，召回率96.07%，进一步检查确诊HPA例，患病率为1/，其中男性例，女性例，男女比例为1.15∶1。例HPA患儿中例（98.11%）诊断为PAH缺乏症，其中经典型PKU90例（33.96%），轻度PKU84例（31.70%），轻度HPA86例（32.45%）；5例患儿诊断为BH4缺乏症（1.89%）。尿蝶呤谱分析结果显示尿新蝶呤为（4.92±2.23）mmol/molCr，生物蝶呤为（0.11±0.04）mmol/molCr，生物蝶呤/（尿新蝶呤+生物蝶呤）×%为（2.45±1.53）%，符合PTPS缺乏症诊断。例患儿进行红细胞DHPR活性测定，结果均正常。
二、治疗效果与随访例HPA患儿中26例拒绝治疗，其中5例为PTPS缺乏症，21例为PKU。拒绝治疗的5例PTPS缺乏症患儿中，1例患儿小头畸形，全身软瘫，反复肺炎，高热，顽固性抽搐，于1岁4月时死亡；1例患儿肌张力低下，吞咽困难，反复发热，营养不良，顽固性抽搐，于1岁8月时死亡；另外3例目前智能和体格发育正常。拒绝治疗的21例PKU患儿均存在不同程度的智能发育落后，智商平均为（48.05±9.79）分。
86例轻度HPA患儿均定期检测血Phe浓度，目前体格及智能发育全部正常，其中1例患儿在随访过程中血Phe浓度连续2次μmol/L，给予适量低Phe饮食治疗。其余85例轻度HPA患儿均未予治疗。
例接受治疗的PKU患儿中3例已死亡。1例于生后12d时开始治疗，血Phe浓度控制在理想范围；生后3个月时因发热、肺炎，夜间呛奶窒息而死。1例合并先天性肾发育不良、肾积水，于生后21d开始治疗，血Phe浓度控制在理想范围；生后7个月时因反复青紫于外院住院期间死亡，电话随访家长，诉具体死亡原因不详。1例于生后50d时开始治疗，血Phe浓度控制在理想范围；生后1岁9个月时因喘息性肺炎伴心功能衰竭，家长延误治疗而死亡。12例在治疗过程中失访，原因主要有以下几个方面：（1）家长外出打工，更换联系方式；（2）经济条件差，不能长期支付高昂的治疗费用；（3）父母离异，患儿由年迈、文化水平低的老人抚养。其余例接受治疗的PKU患儿末次随访年龄为2个月至12岁，按随访时年龄分为3组：≤4岁组62例，4~≤6岁组27例，6岁组49例，各组分别有8例（12.90%）、5例（18.52%）、9例（18.37%）患儿智能发育落后。智能发育水平和血Phe控制浓度呈负相关。见表2和表3。
表2≤4岁组苯丙酮尿症患儿血苯丙氨酸控制浓度与各能区发育商的相关性（n=62）
注：血苯丙氨酸控制浓度为（.91±.85）μmol/L
表34~≤6岁组和6岁组患儿血苯丙氨酸控制浓度与智商的相关性（±s）
讨论
各个国家与地区HPA的发病率及疾病谱有所不同[5]，根据我国新生儿疾病筛查资料显示，我国HPA的患病率为1/[15,16,17]。徐州地区新生儿HPA的筛查率从年的27.54%（/）增加到年的95.98%（/），接近上海、浙江等经济发达地区。HPA的患病率每年都有所变化，但随着筛查人数的增加及筛查率的提高，最近几年的患病率基本稳定。根据徐州地区例资料，HPA患病人数为例，患病率为1/，显著高于全国平均水平，符合我国HPA发病率北高南低的特点[18]。HPA发病率高的原因，除地区因素外，与本地的经济文化发展水平、通婚范围等因素也有关[15]。
我国BH4缺乏症在HPA中的患病率为12.9%[8,17]，并存在显著的地域差异，南部地区BH4缺乏症发病率较高[9,19]，台湾发病率最高[20]，而本研究所在徐州地区BH4缺乏症在HPA中的患病率为1.89%（5/），显著低于全国平均水平。根据脑脊液神经递质代谢产物或临床神经系统症状，将BH4缺乏症分为严重型与轻型。严重型BH4缺乏症患儿脑脊液神经递质代谢产物降低，临床出现神经系统症状；轻型者脑脊液神经递质代谢产物正常，无神经系统症状。由于国内尚未开展脑脊液神经递质代谢产物测定，新生儿筛查中早期诊治者临床多无症状，故BH4缺乏症严重型与轻型分类困难，但可参照已统计的BH4缺乏症基因型与表型关系及临床随访结果进行判断。国外研究中，例BH4缺乏症患儿中PTPS缺乏占56%，DHPR缺乏占32%[2]。Ye等[8]报道了例BH4缺乏症患儿中96%为PTPS缺乏，DHPR缺乏占2.4%，并且绝大多数PTPS及DHPR缺乏症都属于严重型。徐州地区的5例BH4缺乏症均为PTPS缺乏，其中2例已死亡，推测为严重型；另外3例拒绝治疗，但目前患儿智能和体格发育正常，推测为轻型。由于经济条件限制，5例BH4缺乏症患儿均未做相关基因检测。
本研究结果显示，通过新生儿疾病筛查、确诊并坚持治疗的例PKU患儿中，智能发育正常者占84%（/），说明PKU患儿早期开始低Phe饮食治疗，大部分患儿智能发育可达正常水平；其余22例患儿智能发育落后，这可能与起始治疗年龄大、治疗不规范或治疗中断及PAH缺乏严重程度等有关。由此可见，对于新生儿疾病，早诊断、早治疗及提高治疗依从性对患儿的智能发育具有重要意义。PKU患儿若不及时治疗，高浓度的Phe及其异常代谢产物在血液中蓄积，使脑组织受到不可逆的损害，从而导致智力发育落后。国内外大量研究表明，智力发育水平与初筛时血Phe浓度无相关性，而与血Phe的控制浓度和稳定程度有关[21,22]，治疗过程中血Phe浓度高者智商低，Phe浓度低者智商高[23]。本研究结果显示例智能发育正常的PKU患儿血Phe浓度大多控制在理想范围内，且患儿智能发育水平与血Phe控制浓度呈负相关。此研究结果与国内外的报道相符，证实了PKU患儿血Phe浓度控制在理想范围的重要性。Hood等[24]报道了高水平、不稳定的血Phe浓度对PKU患儿脑白质的完整性具有危害，应严格监测并控制血Phe浓度。也有学者报道，智能发育正常的少部分患儿血Phe浓度控制不理想或智能发育落后的少部分患儿血Phe浓度控制较好，这可能与血Phe与大量中性氨基酸竞争通过血脑屏障的多少有关[25]。采用磁共振质子波谱测定脑组织中Phe浓度可发现部分患儿虽然血Phe浓度较高，但脑组织中Phe浓度较低，智能发育基本正常，因此脑组织中Phe浓度较血Phe浓度能更好地反映Phe代谢情况及与智能发育之间的关系[26,27]。deGroot等[28]报道了脑部蛋白质的合成与脑组织Phe浓度呈负相关，与血浆Phe浓度关系不大。
基因检测是HPA病因的确诊方法，建议常规进行，尤其对生化表型不典型、难以确诊的患儿更需及早进行基因诊断，以便正确指导治疗，并为后续的遗传优生咨询和产前诊断提供有效证据。目前为止，国际上已报道近种PAH基因突变类型，具有高度遗传异质性，存在显著的地区和人种差异[4,29]，我国PAH基因突变亦存在地区差异[30,31,32]。至今发现BH4缺乏症也存在多种基因突变，东亚地区已发现43种PTS基因突变类型[31]，35种DHPR基因突变类型[8,20]。传统的基因检测（Sanger测序）滞后于鉴别诊断，且仅局限于单一基因的部分外显子区域，导致整个诊断流程耗时长、遗传信息不完整，还仍有部分患儿得不到明确的基因诊断。近年来，二代测序技术的临床应用打破了传统的诊断策略，能同时将HPA的6个相关基因进行快速、全面、准确检测，做到精准诊断。由于多方面条件的限制，徐州地区只有少部分HPA患儿做了基因检测。以后的工作要争取从传统的诊断模式逐步向新型的精准诊断模式转变。
目前尚无根治PKU的方法，唯一有效的措施是减少Phe的摄入，从而预防智能发育障碍，但也不能完全限制Phe的摄入，因为Phe是人体必需氨基酸之一，必须保证Phe的摄入正好满足机体正常生理代谢需要的水平。其他治疗方法还有大分子中性氨基酸、奶酪乳清提取的无Phe的天然蛋白质糖巨肽[33,34]，苯丙氨酸脱氨酶制剂、酶替代疗法、基因治疗等处于试验阶段[35,36]。DeLuigi等[37]报道了Phe在神经元细胞内具有*性作用，而多西环素可以对抗这一作用，开辟了治疗PKU患儿的新途径，并提供了理论基础。PKU患儿的饮食治疗管理面临很多问题。国内已有研究报道，完全配合治疗的患儿智能发育各个能区均高于不配合治疗的患儿，说明治疗依从性对治疗成功与否至关重要[38]。当然家长对治疗的态度和配合程度受诸多因素的影响，如家长的文化水平、经济条件、家庭关系、生活环境等。另外，国外有学者报道PKU患儿中血浆前蛋白和硒的水平下降，叶酸水平上升[39]，骨密度值降低[40]。因此，关于徐州地区PKU患儿的相关情况有待进一步的研究。
综上所述，全面积极地开展新生儿疾病筛查对HPA的早发现、早治疗至关重要；PKU患儿早期开始并且长期坚持饮食控制，智力发育可达到正常水平，但这需要家长的配合与全社会的支持。
（参考文献：略）
利益冲突声明所有作者均声明本研究不存在利益冲突
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